Bifidobacterium breve w funkcjonowaniu mikrobioty u niemowląt

Ludzki przewód pokarmowy jest jednym z najgęściej zasiedlonych ekostystemów mikrobiologicznych ze zbadanych dotychczas. Mimo iż dokładny skład ludzkiej mikrobioty wymaga jeszcze dalszych badań, nie ma wątpliwości, iż pełni ona kluczową rolę w zdrowiu człowieka [1]. Mikrobiota ludzkiego przewodu pokarmowego to bogaty ekosystem, w którym bytują nie tylko bakterie, ale również grzyby, pajęczaki, wirusy oraz pierwotniaki [2]. Badania przeprowadzane na modelach mysich potwierdzają krytyczną rolę, jaką odgrywa ludzka mikrobiota w rozwoju prawidłowo funkcjonującego przewodu pokarmowego. Ponadto w wypadku dysbiozy mikrobiologicznej stwierdzono częstsze występowanie zaburzeń funkcjonowania tego układu, mianowicie nieswoiste zapalenie jelita grubego, zespół jelita drażliwego, rak żołądka, chłoniak typu MALT, otyłość oraz – co istotne zwłaszcza w populacji wczesnopediatycznej – martwicze zapalenie jelit [1]. 

Jak powstaje mikrobiota dziecka?

Moment życia człowieka, w którym bakterie kolonizują ludzki przewód pokarmowy, jest nadal sporny pomimo licznych badań przeprowadzonych w tym temacie. Można spotkać się z teorią, iż kolonizacja rozpoczyna się już wewnątrzmacicznie, aczkolwiek bardziej popularna jest teoria rozpoczęcia jej w momencie porodu, przy przechodzeniu dziecka przez kanał rodny matki. Po kilku godzinach od porodu dominujące w mikrobiocie noworodka są bakterie z rodzaju Bifidobacterium [3]. 
Droga porodu dziecka oraz sposób karmienia (karmienie mlekiem matki bądź mlekiem modyfikowanym) są uważane za kluczowe czynniki zapewniające zróżnicowane możliwości kolonizacji, a tym samym wpływające na skład mikrobioty noworodka [1]. 
Podczas okresu noworodkowego oraz niemowlęcego bifidobakterie stanowią dominujący rodzaj mikroorganizmów w układzie pokarmowym dzieci karmionych mlekiem matki [4]. Uznanym standardem mikrobioty układu pokarmowego w pierwszych miesiącach życia jest stan osiągnięty jako bezpośredni skutek porodu drogą pochwową donoszonego, zdrowego noworodka, karmionego następnie mlekiem matki przez co najmniej 6 miesięcy. Wysoki poziom bifidobakterii u niemowląt jest powiązany z wysokim poziomem oligosacharydów w mleku matki, które są doskonałą pożywką dla tego rodzaju bakterii. Dodatkowo mleko matki zawiera bakterie komensalne, w tym bifidobakterie, co dodatkowo wspomaga rozwój mikrobioty i prawidłową kolonizację układu pokarmowego. Mleko kobiece poprzez to wspiera prawidłowy rozwój układu odpornościowego dziecka. Dzięki tej wiedzy firmy farmaceutyczne coraz częściej wzbogacają mieszanki mleka modyfikowanego o probiotyczne bakterie, co znacząco zwiększa ich jakość [3]. 

Czym są probiotyki?

Probiotyki według definicji Światowej Organizacji Zdrowia są to „żywe mikroorganizmy, które podane w odpowiedniej ilości wywołują korzystny wpływ na zdrowie gospodarza” [5]. Badania przeprowadzone w ostatniej dekadzie wykazują, iż suplementacja probiotyków może pozytywnie wpływać na kolonizację przewodu pokarmowego oraz zapobiegać i leczyć choroby wieku niemowlęcego [6].
Stosowanie probiotyków jest coraz bardziej popularne wśród rodziców dzieci w wieku do 1. roku życia. Przy ogromie dostępnych preparatów trudno być pewnym skuteczności proponowanych preparatów oraz tego, jak je odpowiednio stosować. 
Towarzystwa naukowe odradzają stosowanie preparatów probiotycznych, które mają w składzie szczepy bez udowodnionego działania prozdrowotnego. Niestety, na rynku jest bardzo wiele takich preparatów. Istnieje wiele dowodów potwierdzających skuteczność prozdrowotną probiotyków w określonych jednostkach chorobowych, jednak niezbędne są dalsze badania w celu ścisłego określenia skutecznych szczepów, prawidłowego ich dawkowania oraz zalecanego czasu stosowania probiotyków, aby osiągnąć jak najlepszy wpływ na stan pacjentów [7]. 
Mechanizmy działania probiotyków można podzielić na 3 grupy, w zależności od częstości występowania. 
Najpowszechniej występujące działania probiotyków to:

• ochrona przed kolonizacją,
• wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych,
• wpływ na pasaż jelitowy,
• stabilizacja i normalizacja mikrobioty,
• wpływ na zwiększoną wymianę enterocytów,
• konkurencja z drobnoustrojami chorobotwórczymi.

Część gatunków wykazuje następujące właściwości: 

• wytwarzanie witamin,
• bezpośredni antagonizm,
• stabilizacja bariery jelitowej,
• metabolizm soli kwasów żółciowych,
• aktywność enzymatyczna i neutralizacja karcynogenów.

Najrzadziej występujące mechanizmy, swoiste dla poszczególnych szczepów, to:

• modulacja odpowiedzi immunologicznej,
• wytwarzanie swoistych substancji bioaktywnych,
• działanie endokrynne i neurogenne.

Jak przedstawiono powyżej, działanie probiotyków na organizm jest bardzo szerokie i ściśle zależy od szczepu [8].

Bifidobacterium species

Bifidobakterie po raz pierwszy opisał w 1899 r. francuski lekarz pediatra Henri Tissier pracujący w paryskim Instytucie Pasteura. Początkowo bakterie te były znane pod nazwą Bacillus bifidus, a wyizolowano je z próbek kału niemowląt karmionych piersią [3]. Bifidobakterie są pierwszą i początkowo najliczniejszą grupą mikroorganizmów w mikrobiocie jelitowej noworodków i niemowląt [1].
Obecnie szczepy bakterii z gatunku Bifidobacterium breve są szeroko używane w pediatrii. Ten konkretny gatunek dominuje w mikrobiocie niemowląt karmionych mlekiem matki. Udowodniono, iż bakterie z tego gatunku mają działanie immunostymulujące. Dodatkowo nie wykazują cech cytotoksyczności ani nie przenoszą oporności na antybiotyki, ponadto mają działanie antybakteryjne wobec ludzkich patogenów. Te cechy powodują, iż zastosowanie B. breve jest bardzo szerokie, na przykład mają zastosowanie w leczeniu biegunki i kolki niemowlęcej, a także są stosowane w profilaktyce zakażeń u wcześniaków oraz podczas antybiotykoterapii i chemioterapii [2].
Dzięki licznym badaniom wiadomo, jak ważna dla zdrowia dziecka jest prawidłowa mikrobiota. Ważna jest też wiedza dotycząca tego, jak zapewnić prawidłowy skład mleka matki oraz mikrobioty organizmu matki, aby kolonizacja dziecka przebiegała w prawidłowy sposób. Zmiany w diecie matki wpływają na skład mleka, w tym oligosacharydy oraz bifidobakterie w nim występujące [9].
Oprócz diety, istotne dla prawidłowej mikrobioty noworodka są również styl życia matki w trakcie ciąży obejmujący: umiarkowaną aktywność fizyczną i wykluczenie używek, niestosowanie antybiotyków podczas ciąży oraz w początkowych miesiącach życia dziecka, a także wymienione wcześniej: poród drogą pochwową, donoszenie ciąży do pełnej dojrzałości dziecka oraz karmienie mlekiem matki [3]. 
Podczas porodu drogą pochwową dziecko ma kontakt z bakteriami pochwowymi oraz jelitowymi matki, to jest bakteriami z rodzajów Bifidobacterium, Lactobacillus i Prevotella. Natomiast podczas cięcia cesarskiego istnieje większe prawdopodobieństwo kolonizacji noworodka przez bakterie bytujące na powierzchni skóry, między innymi Staphylococcus i Corynebacterium. Czynniki poporodowe, czyli przede wszystkim karmienie dziecka mlekiem matki, wpływają na skład mikrobioty przez cały pierwszy rok życia. Jednak nawet po 12 miesiącach bifidobakterie nadal dominują w środowisku jelitowym dzieci karmionych piersią [9]. 
Kolejnym czynnikiem, niestety zazwyczaj niezależnym od nas, a znacznie wpływającym na skład mikrobioty dziecka, jest wcześniactwo. U dzieci urodzonych przedwcześnie zaobserwowano zwiększone występowanie w mikrobiocie mikroorganizmów oportunistycznych oraz potencjalnie patogennych, a jednocześnie zmniejszony poziom oraz opóźnioną kolonizację takimi bakteriami jak bifidobakterie. Według badań w mikrobiocie dzieci urodzonych przedwcześnie, czyli przed 37. tygodniem ciąży, najbardziej dotkniętą grupą z prawidłowej mikrobioty są właśnie bifidobakterie, których obniżony poziom utrzymuje się przez pierwsze trzy miesiące życia dziecka, a nawet do drugiego roku życia [3]. 

Zastosowanie Bifidobacterium breve u niemowląt

Zastosowanie bakterii Bifidobacterium breve w zapobieganiu oraz leczeniu chorób znacząco wzrosło w ostatniej dekadzie. Z racji na fakt, iż najliczniej te bakterie występują w populacji pediatrycznej, najwięcej badań dotyczy właśnie tej grupy. Wykazano, iż B. breve mają zastosowanie w kolkach niemowlęcych, celiakii, otyłości, zaparciach, alergiach, u wcześniaków, w martwiczym zapaleniu jelit, a także przy chemioterapii oraz po zabiegach chirurgicznych [2]. Co więcej, zaburzenia składu mikrobioty w wieku niemowlęcym wiążą się ze zwiększonym ryzykiem występowania otyłości, cukrzycy, chorób metabolicznych oraz ogólnej śmiertelności z innych przyczyn chorobowych w późniejszych etapach życia [9].
Oprócz dobroczynnego działania powierzchniowego, jakie wykazują bifidobakterie, korzystne działanie mają także metabolity, które te bakterie produkują. Głównym produktem ubocznym wydalanym przez bifidobakterie są krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, z których najważniejsze to: mrówczan, octan, maślan i propionian, ponieważ stanowią one główną grupę kwasów tłuszczowych występujących w jelicie grubym człowieka, a konkretnie w okrężnicy. Te substancje wpływają na szczelność bariery jelitowej, na pH przewodu pokarmowego oraz na hamowanie rozwoju patogenów [9]. Dla zdrowia dzieci natomiast najważniejszym z nich jest maślan, jako że jest on główną pożywką dla kolonocytów, które budują ścianę jelita grubego [10]. Stanowi to wyjaśnienie zmniejszonej częstości występowania chorób metabolicznych u osób, których mikrobiota w pierwszych latach życia była bogata w bifidobakterie. Dodatkowo niedobór bifidobakterii w mikrobiocie wiąże się z takimi schorzeniami jak kamica nerkowa i przewlekła choroba nerek [11]. Metabolity bifidobakterii, jak wcześniej podkreślano, hamują rozwój patogenów. Tę rolę odgrywają przede wszystkim kwas octowy oraz mlekowy, które negatywnie wpływają na bakterie z rodzaju Salmonella oraz Listeria, przez co obecność tych metabolitów w układzie pokarmowym człowieka może wpływać na ograniczenie występowania infekcji [12]. 
Oprócz wpływu na układ pokarmowy, zmniejszona kolonizacja bifidobakteriami jest także związana z podwyższonym ryzykiem chorób atopowych, takich jak zapalenie skóry. Zważywszy na to, że choroby atopowe są związane z nadmierną odpowiedzią immunologiczną przeciwciał IgE, prawdopodobne jest, że bifidobakterie wpływają na modulację odpowiedzi organizmu na alergeny. Ten mechanizm działania bifidobakterii nie jest jeszcze do końca poznany, ale przeprowadzone dotychczas badania wykazały, iż zmniejszenie liczby tych bakterii w organizmie może zwiększać ryzyko wystąpienia alergii [13]. 

Kolki

Jednym z najczęściej zgłaszanych przez rodziców problemem są kolki niemowlęce, które dotykają nawet do 30% dzieci w pierwszych miesiącach życia. Charakteryzują się one napadowym, niekontrolowanym płaczem bez widocznej przyczyny. Kolki niemowlęce nie tylko stanowią poważny kłopot dla rodziców, ale też w wielu przypadkach mogą powodować zaburzenia w późniejszym życiu [14]. 
Według przeprowadzonych dotychczas badań wybrane szczepy B. breve zastosowane u dzieci cierpiących na kolki niemowlęce pozwalają na redukcję czasu trwania epizodów płaczu związanych z kolką [2]. Wykazano także, iż u dzieci karmionych wyłącznie mlekiem modyfikowanym efekt ten jest większy – w porównaniu do placebo płacz podczas kolek trwał o 57% krócej u dzieci suplementowanych bakteriami B. breve (w przypadku tego badania konkretnie szczepami BR03 oraz B632) [15]. Ten konkretny zestaw szczepów zapobiega również zaburzeniom pokarmowym u zdrowych dzieci karmionych piersią, mianowicie zmniejszał częstość ulewań oraz poprawiał konsystencję stolców [2]. U dzieci karmionych mlekiem modyfikowanym taka suplementacja dodatkowo przywraca równowagę mikrobioty jelitowej. Ponadto takie połączenie szczepów, dotychczas w badaniach in vitro, wykazuje aktywność przeciw bakteriom E. coli oraz Klebsiella sp., które mogą współodpowiadać za występowanie kolek niemowlęcych [15]. 

Wcześniaki

U dzieci przedwcześnie urodzonych często spotykamy się z niedojrzałością mikrobioty układu pokarmowego oraz z opóźnioną kolonizacją tego układu bakteriami komensalnymi, takimi jak bifidobakterie. Oprócz tego wcześniaki są bardziej narażone na kolonizację bakteriami patogennymi, takimi jak enterobakterie oraz enterokoki [16]. 
Stosowanie antybiotyków u dzieci urodzonych przedwcześnie oraz ze skrajnie niską wagą urodzeniową zaburza kolonizację mikrobioty bifidobakteriami. U tych dzieci mikrobiota jest kolonizowana w większym stopniu przez proteobakterie, a dodatkowo całkowita różnorodność mikrobioty jest znacznie ograniczona [4]. 
Liczne kohortowe badania wykazują, iż wczesna suplementacja bifidobakterii, konkretnie szczepu M-16 V, ma potencjalny pozytywny wpływ na poprawę kolonizacji przewodu pokarmowego wcześniaków oraz dzieci z niską masą urodzeniową przez bifidobakterie. Efekty takiej suplementacji obserwowano już po trzech tygodniach podaży B. breve M-16 V w dawce 3 × 109 CFU na dzień. U tych niemowląt zaobserwowano znaczący wzrost udziału B. breve w kale w porównaniu do grupy kontrolnej, u której poziom tych bakterii był poniżej progu wykrywalności [16].
Ponadto wykazano, iż szczep M-16 V zmniejsza u wcześniaków ryzyko wystąpienia martwiczego zapalenia jelit, sepsy oraz śmierci [4]. Efekt ten zaobserwowano zwłaszcza u noworodków urodzonych przed 34. tygodniem ciąży [17]. Dodatkowo suplementacja B. breve M-16 V wspomaga rozwój funkcji odpornościowych u wcześniaków poprzez pozytywny wpływ na barierę jelitową oraz łagodzi stany zapalne [4]. 
Bifidobakterie bardzo skutecznie kolonizują niedojrzałe jelita wcześniaków i przez to zmniejszają częstość występowania niepożądanych objawów ze strony układu pokarmowego, a także wspomagają przyrost masy ciała u dzieci ze skrajnie niską masą urodzeniową. Wynika to ściśle ze stabilizacji ich mikrobioty jelitowej [18]. 

Alergie 

Częstość występowania alergii u niemowląt w ciągu ostatnich dziesięcioleci stale wzrasta. Patogeneza chorób alergicznych jest złożona, ale zaburzenia kolonizacji mikrobioty jelitowej we wczesnych etapach życia mogą być jednym z głównych czynników sprzyjających nieprawidłowemu dojrzewaniu układu odpornościowego po urodzeniu [19]. 
Jak wspomniano wcześniej, B. breve M-16 V może wspomagać kolonizację układu pokarmowego bifidobakteriami, a przez to ten szczep pośrednio może zapobiegać lub zmniejszać nasilenie chorób alergicznych u dzieci, w tym atopowego zapalenia skóry, alergii pokarmowych, alergicznego nieżytu nosa oraz astmy. Doustna podaż M-16 V znacząco łagodzi objawy atopowego zapalenia skóry u niemowląt, co wykazano w randomizowanym kontrolowanym badaniu i porównano efekty z grupą kontrolną otrzymującą placebo [20]. 
Kolejne badanie, obejmujące niemowlęta obciążone nadwrażliwością na mleko krowie objawiającą się atopowym zapaleniem skóry, wykazało, iż suplementacja M-16 V w dawce 3 × 109 CGU na dzień przez 3 miesiące złagodziła objawy alergiczne występujące u tych dzieci oraz poprawiła skład ich mikrobioty jelitowej [21]. 
Co ciekawe, udowodniono również, iż suplementacja bifidobakterii M-16 V przez matki podczas ciąży oraz w okresie połogu zmniejsza ryzyko rozwoju chorób alergicznych u niemowląt [22]. 
Ponadto podaż bifidobakterii M-16 V zapobiega wystąpieniu objawów astmatycznych u dzieci z atopowym zapaleniem skóry [23]. 
Podsumowując wyniki tych licznych badań, można stwierdzić, że suplementacja B. breve M-16 V może mieć działanie profilaktyczne poprzez poprawę immunotolerancji u niemowląt i przez to chronić dzieci z grup ryzyka przed wystąpieniem chorób alergicznych w późniejszych etapach ich życia. 

Podsumowanie

Ze względu na swój wpływ na rozwój i dobrostan organizmu człowieka mikrobiota jelitowa może być uznana za jeden z kluczowych czynników mających wpływ na nasze zdrowie. W mikrobiocie noworodków i niemowląt prym wiodą bakterie z rodzaju Bifidobacterium, w tym gatunek Bifidobacterium breve, który jest jednym z najlepiej przebadanych gatunków bakterii probiotycznych. Rola tych bakterii w rozwoju organizmu człowieka jest nieoceniona i nie należy lekceważyć roli prawidłowej diety w rozwoju zdrowej mikrobioty u niemowląt. 
U zdrowych niemowląt suplementacja probiotykami zawierającymi gatunek B. breve ma zastosowanie u dzieci dotkniętych kolkami niemowlęcymi oraz – w świetle najnowszych badań – może mieć rolę w prewencji oraz w łagodzeniu objawów alergii. Dla dzieci urodzonych przedwcześnie, z niską masą urodzeniową, poprzez cięcie cesarskie bądź karmionych mlekiem modyfikowanym suplementacja bifidobakterii, zwłaszcza Bifidobacterium breve, jest zalecana ze względu na korzyści, jakie wykazano w licznych badaniach, aczkolwiek konieczne są dalsze badania celem określenia szczepów najlepiej sprawdzających się w konkretnych jednostkach chorobowych. 
Firmy farmaceutyczne coraz częściej wychodzą naprzeciw potrzebom rodziców i ułatwiają wprowadzenie suplementacji probiotykami u najmłodszych. Niewątpliwie potrzebne są dalsze badania celem wybrania szczepów o najkorzystniejszym działaniu i określenia dawkowania, zanim probiotyki staną się standardowym składnikiem mleka modyfikowanego, jednak już teraz możemy się spotkać z produktami gotowymi, wzbogaconymi o dobroczynne bakterie. 
Zastosowanie bakterii z gatunku Bifidobacterium breve w populacji noworodków i niemowląt jest bardzo szerokie. W świetle prowadzonych licznych badań klinicznych możemy się spodziewać jedynie dalszych możliwości ich zastosowania w medycynie. 

Piśmiennictwo:

1. Turroni F., Peano C. et al., Diversity of bifidobacteria within the infant gut microbiota, „PLOS ONE” 7, 2012.
2. Bozzi Cionci N., Baffoni L. et al., Therapeutic Microbiology: The Role of Bifidobacterium breve as Food Supplement for the Prevention/Treatment of Paediatric Diseases, „Nutrients” 10(11), 2018, 1723. 
3. Saturio S., Nogacka, A. et al., Role of bifidobacteria on infant health, „Microorganisms” 9(12), 2021.
4. Milani C., Duranti S. et al., The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota, „Microbiol. Mol. Biol. Rev.” 2017.
5. FAO/WHO, Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, 2001.
6. Wong C.B., Iwabuchi N. et al., Exploring the Science behind Bifidobacterium breve M-16V in Infant Health, „Nutrients” 11(8), 2019.
7. Szajewska H., Berni Canani R. et al., Probiotics for the Management of Pediatric Gastrointestinal Disorders: Position Paper of the ESPGHAN Special Interest Group on Gut Microbiota and Modifications, „JPGN” 76(2), 2023.
8. Szajewska H., Probiotyki i prebiotyki, w: Szajewska H., Horvath A., Żywienie i leczenie żywieniowe dzieci i młodzieży, „Medycyna Praktyczna” 2017, 82–86.
9. Stuivenber G.A., Burton J.P. et al., Why are bifidobacteria important for infants? „Microorganisms” 10(2), 2022, 278.
10. Canani R.B., Di Costanzo M. et al., Potential beneficial effects of butyrate in intestinal and extraintestinal diseases, „World J. Gastroenterol.” 17, 2011, 1519–1528.
11. Stanford J., Charlton K. et al., The gut microbiota profile of adults with kidney disease and kidney stones: A systematic review of the literature, „BMC Nephrol.” 21, 2020, 215.
12. Bäckhed F., Roswall J. et al., Dynamics and stabilization of the human gut microbiome during the first year of life, „Cell Host Microbe” 17, 2015, 690–703.
13. Sun S., Luo L. et al., Bifidobacterium alters the gut microbiota and modulates the functional metabolism of T regulatory cells in the context of immune checkpoint blockade, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA” 177, 2020, 27509–27515.
14. Indrio F., Di Mauro A. et al., Infantile colic, regurgitation, and constipation: An early traumatic insult in the development of functional gastrointestinal disorders in children? „Eur. J. Pediatr.” 174, 2015, 841–842.
15. Giglione E., Prodam F. et al., The Association of Bifidobacterium breve BR03 and B632 is Effective to Prevent Colics in Bottle-fed Infants: A Pilot, Controlled, Randomized, and Double-Blind Study, „Journal of Clinical Gastroenterology” 50, 2016, 164–167. 
16. Wong C.B., Iwabuchi N. et al., Exploring the Science behind Bifidobacterium breve M-16V in Infant Health, „Nutrients” 11(8), 1724.
17. Patole S., Keil A.D. et al., Effect of Bifidobacterium breve M-16V supplementation on fecal bifidobacteria in preterm neonates-a randomised double blind placebo controlled trial, „PLoS ONE” 9, 2014.
18. Kitajima H., Sumida Y. et al., Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial, „Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed.” 76(2), 1997.
19. West C.E., Jenmalm M.C. et al., The gut microbiota and its role in the development of allergic disease: A wider perspective, „Clin. Exp. Allergy” 45, 2015, 43–53.
20. Hattori K., Yamamoto A. et al., Effects of administration of bifidobacteria on fecal microflora and clinical symptoms in infants with atopic dermatitis, „Arerugi” 52, 2003, 20–30.
21. Enomoto T., Sowa M. et al., Effects of bifidobacterial supplementation to pregnant women and infants in the prevention of allergy development in infants and on fecal microbiota, „Allergol. Int.” 63, 2014, 575–585.
22. Fiocchi A., Pawankar R. et al., World Allergy Organization-McMaster university guidelines for allergic disease prevention (GLAD-P): Probiotics, „World Allergy Organ J.” 8, 2015, 1.
23. Van der Aa L.B., Van Aalderen W.M. et al., Synbiotics prevent asthma-like symptoms in infants with atopic dermatitis, „Allergy” 66, 2011, 170–177.